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常用的融合蛋白分為哪幾類(lèi)的呢

更新時(shí)間:2015-06-05 點(diǎn)擊次數(shù):5030
常用的融合蛋白從分子量和用途上來(lái)分,一般可分為如下三類(lèi): 

1. 小分子量的融合肽:這類(lèi)標(biāo)簽蛋白只有幾個(gè)氨基酸,如poly His,StrepII-tag,F(xiàn)LAG,c-myc-等,主要用于靶蛋白的純化,也可用于靶蛋白的輔助檢測(cè),且由于分子量很小,幾乎不干涉靶蛋白的結(jié)構(gòu),活性和功能,一般純化后不用去除標(biāo)簽,非常簡(jiǎn)單方便。目前zui常使用的是poly His標(biāo)簽蛋白,可使用金屬離子親和層析(IMAC)進(jìn)行純化,用梯度濃度咪唑溶液洗脫。當(dāng)靶蛋白為包涵體時(shí),也可在變性條件下純化靶蛋白,容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?;?,是目前應(yīng)用的方法。但是該方法也有自身的局限性,由于許多蛋白有內(nèi)在的組氨酸和/或半胱氨酸氨基酸殘基,其它的非特異蛋白與靶蛋白一起與金屬離子親和層析柱料發(fā)生結(jié)合,影響靶蛋白的純度;另外,咪唑可能會(huì)影響晶體學(xué),NMR等實(shí)驗(yàn);咪唑也會(huì)導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)的聚集;由于金屬離子可吸附到NTA樹(shù)脂上,帶金屬離子中心的蛋白質(zhì)也不適合用該方法純化,另外Ni2+-NTA可被還原,在厭氧條件下也不適合使用該方法。
Strep-tagII,只有8個(gè)氨基酸(色氨酸-絲氨酸-組氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-谷氨酸-賴(lài)氨酸)的小標(biāo)簽,該標(biāo)簽與固定在以Sepharose為基礎(chǔ)的基質(zhì)上的Strep-Tactin 配基特異性結(jié)合,并且Strep-tagII與Strep-Tactin的結(jié)合親和力比鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合親和力多大約100倍,使得StrepTactin Sepharose 高性能適合純化Strep-tag II蛋白,得到的靶蛋白純度更高。純化均在生理?xiàng)l件下進(jìn)行,使用脫硫生物素溫和的洗脫很好地保護(hù)了靶蛋白的活性。Strep-tag II的*性能被越來(lái)越多的科研者認(rèn)識(shí)并應(yīng)用。
 
2. 大分子量增溶性融合蛋白:如GST (谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶), MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白),SUMO(泛素樣修飾蛋白),NusA(轉(zhuǎn)錄終止抗終止因子),TrxA(大腸桿菌硫氧還蛋白),DsbA(蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶)等,這類(lèi)融合蛋白的主要功能是提高靶蛋白的可溶性,促進(jìn)靶蛋白正確折疊,提高穩(wěn)定性。其中GST標(biāo)簽蛋白可直接利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione sepharose)親和樹(shù)脂進(jìn)行純化,MBP融合蛋白可通過(guò)交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。其他幾個(gè)融合蛋白則不能直接純化,蛋白融合構(gòu)建時(shí)需要和用于純化的小標(biāo)簽聯(lián)用,如在靶蛋白N端融合His-SUMO的方式。但是由于這些融合蛋白的分子量比較大,容易影響到靶蛋白的構(gòu)象和功能,因此純化后需要切除,通常的方式是在融合蛋白和靶蛋白之間加入蛋白酶(一般有腸激酶,TEV,凝血酶,Xa因子)識(shí)別特異序列,切割后經(jīng)過(guò)親和層析,去除標(biāo)簽蛋白部分,得到靶蛋白,但會(huì)在靶蛋白N端殘留2-3個(gè)氨基酸,一般不會(huì)影響靶蛋白的結(jié)構(gòu)和活性,但有些蛋白的活性對(duì)N端的外源氨基酸很敏感,甚至多出一個(gè)外源氨基酸都會(huì)影響到蛋白的活性。
需要重點(diǎn)指出SUMO作為融合蛋白的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn),即SUMO蛋白酶特異地識(shí)別完整的SUMO標(biāo)簽蛋白序列,*移除SUMO標(biāo)簽蛋白,不會(huì)殘留外源氨基酸。SUMO蛋白酶在較寬范圍的反應(yīng)環(huán)境體系中保持較高的活力,例如溫度(4~30℃)、pH(5.5~9.5)等。SUMO蛋白酶帶有多聚His標(biāo)簽,融合蛋白切割后可進(jìn)行親和層析純化,去除SUMO蛋白酶,得到天然的目的蛋白。針對(duì)SUMO的這一優(yōu)勢(shì),目前科研人員對(duì)SUMO進(jìn)行改造,提高其穩(wěn)定性,開(kāi)發(fā)了一系列SUMO融合表達(dá)產(chǎn)品,分別針對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng),酵母表達(dá)系統(tǒng),昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體和SUMO蛋白酶等,被越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。
 
3. 報(bào)告性融合蛋白:這類(lèi)融合蛋白常用的有eGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白),eCFP(增強(qiáng)型青色熒光蛋白)和eYFP(增強(qiáng)型黃色熒光蛋白)等熒光蛋白,均由野生型熒光蛋白通過(guò)氨基酸突變而來(lái),熒光強(qiáng)度更強(qiáng)、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。融合這些熒光蛋白,可進(jìn)行目標(biāo)基因的活細(xì)胞檢測(cè),這些熒光蛋白自發(fā)熒光,無(wú)需使用抗體或原位雜交等技術(shù),無(wú)需破碎組織細(xì)胞,直接通過(guò)熒光顯微鏡就可在活細(xì)胞狀態(tài)下實(shí)時(shí)觀察目的基因在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位和表達(dá)情況,可謂活細(xì)胞探針。如果兩個(gè)蛋白分別融合不同熒光蛋白,通過(guò)FRET原理,還可進(jìn)行活體細(xì)胞中蛋白互作的研究。熒光蛋白作為標(biāo)簽蛋白,還有以下優(yōu)勢(shì):自發(fā)熒光,不用破碎組織細(xì)胞,觀察目的基因的實(shí)時(shí)定位和表達(dá)情況;熒光性質(zhì)穩(wěn)定,不受細(xì)胞內(nèi)其他產(chǎn)物的干擾;消耗低,檢測(cè)快速簡(jiǎn)便,靈敏度高且重現(xiàn)性好,非常適合高通量的藥物篩選。目前這些熒光蛋白已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基團(tuán)表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因功能研究、蛋白在細(xì)胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等。

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