RNAscope® 由美國Bio-Techne旗下ACD公司于2012 年推出，是一項(xiàng)新型的RNA原位雜交技術(shù)。它是基于ACD?！だ碾pzz型探針設(shè)計(jì)，寡核苷酸互補(bǔ)配對的信號放大系統(tǒng)，通過酶催化底物，可在顯微鏡下看到熒光或可見光的信號。不僅實(shí)現(xiàn)了單一分子RNA的原位檢測，還可實(shí)現(xiàn)在一張組織切片上標(biāo)記多個(gè)不同的RNA分。根據(jù)試劑盒的不同，分為熒光試劑盒和可見光試劑盒。該技術(shù)可以應(yīng)用到多種類型的樣本中，如石蠟包埋樣本，冰凍樣本，貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞樣本等。

RNAscope®技術(shù)原理

RNAscope® 獨(dú)·特的雙Z (ZZ)探針設(shè)計(jì)有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時(shí)降低了背景干擾。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針是由20對雙Z探針組成，每個(gè)Z靶向探針由三部分組成：Z型探針底部是一個(gè)18到25堿基長度的序列能夠互補(bǔ)結(jié)合到目標(biāo)RNA上。這個(gè)序列是基于目標(biāo)序列的不同，以及獨(dú)·特的結(jié)合特征而進(jìn)行的特異性設(shè)計(jì)。Z型探針的中部是一個(gè)間隔序列，鏈接了探針的上下兩端。Z型探針的頂端是一個(gè)14堿基長度的尾部序列。因而一對Z形探針對的頂端序列組合成一段28個(gè)堿基長度的結(jié)合區(qū)以供信號放大前體序列的結(jié)合。

RNAscope®技術(shù)的優(yōu)勢

特異性：Z形探針對的設(shè)計(jì)屏蔽了背景噪音。單獨(dú)·一個(gè)Z形探針對即使結(jié)合上非目標(biāo)序列也無法提供信號放大前體序列結(jié)合所需要的足夠長度，從而防止了對于非特異信號的擴(kuò)增，保障了特異性；

靈敏度：每三對Z形探針對就足以實(shí)現(xiàn)對一個(gè)RNA分子的檢測。在RNA分子出現(xiàn)部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情況下，20對Z形探針對的設(shè)計(jì)保障了足夠強(qiáng)勁有效的檢測RNA ；

提供qPCR無法提供的原位信息、形態(tài)信息；

單分子量級的可視性與量化分析：此20x20x20x的引物設(shè)計(jì)與信號放大原理讓單一RNA分子能夠在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下以一個(gè)點(diǎn)狀信號的方式可視化呈現(xiàn)；

能夠探測到降解的RNA ：得益于其相對短小的目標(biāo)結(jié)合區(qū)域(Z形探針對的底端40到50個(gè)堿基長度)，此Z形探針對的設(shè)計(jì)為檢測到部分降解的RNA提供了保障；

同時(shí)檢測多個(gè)靶點(diǎn)：可見光雙靶點(diǎn)RNA的檢測、 3個(gè)靶點(diǎn)RNA的熒光檢測及RNA和蛋白分子的同步檢測。

RNAscope®操作步驟

Step 1透化：通過RNAscope®預(yù)處理試劑盒處理載玻片上固定好的組織或細(xì)胞，以暴露目標(biāo)RNA。

Step 2雜交：RNAscope®針對靶基因設(shè)計(jì)的20對Z型目標(biāo)探針與目標(biāo)RNA雜交。

Step 3信號放大：RNAscope®檢測試劑盒通過信號擴(kuò)增序列與顯色標(biāo)記有序互補(bǔ)結(jié)合，從而擴(kuò)大信號。

Step 4可視信號形成：在透視光學(xué)顯微鏡或者多光譜成像系統(tǒng)的觀測下，每一個(gè)目標(biāo)RNA分子以一個(gè)點(diǎn)狀信號的形式呈現(xiàn)。

Step 5量化分析：顯微鏡下，直接計(jì)數(shù)或者使用HALO自動(dòng)化圖像分析軟件，對每一個(gè)細(xì)胞中的RNA單分子信號進(jìn)行精確定量分析。

RNAscope®結(jié)果分析

顯微鏡觀察結(jié)果并分析

根據(jù)每個(gè)細(xì)胞中觀察到的點(diǎn)狀信號評分（定量），評分標(biāo)準(zhǔn)如下圖所示：

RNAscope®檢測應(yīng)用

1、腫瘤相關(guān)靶標(biāo)檢測

由于全基因組基因表達(dá)譜技術(shù)的廣泛使用，RNA生物標(biāo)志物或基因表達(dá)特征已成為一類主要的癌癥生物標(biāo)志物。目前臨床診斷分析中使用的平臺(tái)是實(shí)時(shí)RT-PCR，這種方法有一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn):RNA提取的過程破壞了基因表達(dá)測量的組織背景，使得不可能將觀察到的信號映射到單個(gè)細(xì)胞。此外，這些檢測容易受到意想不到的細(xì)胞類型(如非癌細(xì)胞)和不想要的組織成分(如纖維化和壞死)的干擾。相比之下， RNAscope®允許將分子信息與組織病理學(xué)相結(jié)合，以獲得最佳的臨床解釋。

RNAscope檢測FFPE腫瘤組織中RNA。A:原發(fā)腫瘤組織(乳腺、肺和前列腺)的顯色染色(DAB)，與泛素C (UBC)探針或細(xì)菌基因dapB探針雜交作為陰性對照。細(xì)胞核用蘇木精反染。B: FFPE樣品中低拷貝轉(zhuǎn)錄物的熒光檢測。乳腺腫瘤組織切片用無探針或Alexa Fluor 488標(biāo)記探針組(綠色)與HPRT1或POLR2A雜交。細(xì)胞核用DAPI反染(藍(lán)色)。[1]

2、分泌型蛋白的檢測

一些分泌蛋白，如生長因子、細(xì)胞因子等，這些蛋白的IHC檢測可能存在缺乏公·認(rèn)的有效的抗體，蛋白結(jié)果難以判讀等問題，通過RNAscope檢測其mRNA的表達(dá)可能更易得到有效的檢測結(jié)果。

3、點(diǎn)突變、可變剪切的檢測

對于點(diǎn)突變、可變剪切以及高度同源序列翻譯產(chǎn)物的檢測，因無法生成有效抗體從而無法在蛋白水平進(jìn)行原位檢測，通過RNAscope來可視化定位是很好的替代方法。

4、RNAscope®檢測其他應(yīng)用

腫瘤生物標(biāo)志物、腫瘤微環(huán)境檢測；

免疫與免疫治療、免疫微環(huán)境檢測；

神經(jīng)研究領(lǐng)域Marker、GRCR、神經(jīng)激活與可塑性研究等；

病毒、病毒與宿主相互作用，如HPV、HIV、AAV、溶瘤病毒等；

干細(xì)胞標(biāo)記與干細(xì)胞微環(huán)境；

基因治療、CART安全性評估、TCR-Tcell等多種細(xì)胞治療；