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細胞培養(yǎng)中檢測支原體的常用方法

更新時間:2021-04-06 點擊次數(shù):2348

支原體是1898年Nocard等發(fā)現(xiàn)的一種類似細菌但不具有細胞壁的原核微生物,能在無生命的人工培養(yǎng)基上生長繁殖,直徑50-300nm,能通過細菌濾器。支原體在過去曾稱之為類胸膜肺炎微生物(pleuropneumonia-like organism,PPLO),1967年正式命名為支原體。

 

支原體(mycoplasma):又稱霉形體,為目前發(fā)現(xiàn)的原核生物,基因數(shù)量為480。支原體細胞中可見的細胞器是核糖體(支原體是原核細胞,原核細胞的細胞器只有核糖體)。支原體結(jié)構(gòu)也比較簡單,多數(shù)呈球形,沒有細胞壁,只有三層結(jié)構(gòu)的細胞膜,故具有較大的可變性。

 

支原體這種微小的微生物,是細胞培養(yǎng)中令人頭疼的大問題。支原體污染可能來自培養(yǎng)基、血清或?qū)嶒灢僮髡?,會影響細胞生長率、細胞形態(tài)、基因表達、細胞代謝和細胞活力。支原體感染不易察覺,因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測就非常重要。

污染實驗室培養(yǎng)細胞的支原體主要有八種,但還沒有哪種檢測方法能夠單槍匹馬把這八種支原體都檢測出來。支原體非常頑強,通常用于細胞培養(yǎng)的絕大多數(shù)抗生素都對其無效。例如青霉素主要作用于細菌細胞壁,但支原體沒有細胞壁因此就不受影響。無懈可擊的細胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預(yù)防支原體感染的方式,另外及時找出受到支原體感染的培養(yǎng)物也很重要,這樣才能在感染擴散前快速采取有效措施。下面就為大家介紹幾種在培養(yǎng)細胞中檢測支原體的方法。

 

分離培養(yǎng)法

 

分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標方法,其檢測度高。這種方法是從可疑的細胞培養(yǎng)體系中取樣,并接種到支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體,它們就會在這種瓊脂平板上*生長,形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果,因此被譽為支原體檢測金標準。不過分離培養(yǎng)法也存在兩個弊端,一是檢測時間太長,支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。二是盡管可以檢測絕大多數(shù)支原體種類,分離培養(yǎng)法也有力所不及的時候,例如支原體M. hyorhinis。

 

DNA檢測法

 

DNA檢測需要將可疑樣品與指示細胞共同培養(yǎng),因此一般需要幾天時間。DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細胞,如果原樣本中含有支原體,那么當細胞DNA被熒光染料(如Hoechst染料)染色時,就可以在指示細胞的核周圍觀察到熒光斑點或熒光顆粒。分離培養(yǎng)法用來檢測支原體M. hyorhinis菌株并不可靠,而DNA法可以準確的將其檢測出來。

   

 

PCR  

 

PCR法也可以檢測M. hyorhinis菌株,PCR法檢測支原體只需幾個小時,是但也是的支原體檢測方法。該方法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本,其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過程中,支原體DNA會顯示為特異性條帶,以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測大多數(shù)支原體,但謹慎起見同時使用另一種檢測方法來進行驗證。

 

酶學(xué)檢測和ELISA

 

此外,也還存在一些其他支原體檢測方法。例如酶學(xué)檢測是將可疑樣本添加到特定底物中,在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP,隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。ELISA也能用于支原體檢測,以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體,來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。

 

 

定期檢測法

 

支原體感染會使培養(yǎng)細胞慢慢枯萎,因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應(yīng)該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去,是細胞培養(yǎng)實驗室應(yīng)對支原體感染的關(guān)鍵。

 

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